Potyvirus屬病毒為重要的植物病毒屬之一，根據ICTV正式命名的病毒數目已多達162種。此屬病毒能夠經由蚜蟲或機械傳播，且屬內某些病毒的寄主廣泛，造成嚴重的經濟損失。為了能夠降低農損與防止病毒傳播，研發有效率且低費用的病毒檢測方法是重要的課題之一。
我們實驗室長期針對海芋病毒進行研究，發現海芋至少能夠被五種potyvirus感染，包括海芋潛徵病毒(Calla lily latent virus, CLLV)、芋頭嵌紋病毒(Dasheen mosaic virus, DsMV)、蒟蒻嵌紋病毒(Konjak mosaic virus, KoMV)、蕪菁嵌紋病毒(Turnip mosaic virus, TuMV)與海芋微嵌紋病毒(Zantedeschia mild mosaic virus, ZaMMV)病毒(圖一)。為了能夠同時檢測這五種potyvirus，我們融合並表現DsMV、KoMV與ZaMMV鞘蛋白之121個高保守性胺基酸作為抗原，藉此提高得到抗Potyvirus屬病毒的廣效性單株抗體的機率(圖二)。經過篩選，我們得到一個穩定的融合瘤細胞株，命名為C4，其分泌的單株抗體除了對於上述五種海芋病毒皆有專一的結合力外，同時還能辨識其他九種Potyvirus屬病毒(圖三與圖四)。此外為了進一步降低生產抗體的費用，我們亦選殖了C4單株抗體的變異區，將其建構為C4單鏈抗體(scFv)。並在大腸桿菌表現系統中，利用新的外泌訊息胜肽(PelE)來促進單鏈抗體的外泌效果(圖五)。最後從西方墨點分析與ELISA結果可知，C4單鏈抗體與C4單株抗體都對potyvirus有高度的專一性(圖三、圖四與圖六)，可有效應用在多種Potyvirus屬病毒的檢測上。
Reference
Liu, H.-L., Lin, W.-F., Hu, W.-C., Lee, Y.-A., and Chang, Y.-C. 2015. A strategy for generating a broad-spectrum monoclonal antibody and soluble single-chain variable fragments against plant potyviruses. Applied and Environmental Microbiology 81 (19): 6839-6849. doi:10.1128/AEM.01198-15
http://aem.asm.org/content/81/19/6839.long
圖一、(A) KoMV與ZaMMV感染的海芋植株，在葉片上可見到褪綠、嵌紋與畸形等病徵；(B) 對於開花的影響包含花梗縮短、花苞畸形與花苞數減少等情形。
圖二、(A) 五種海芋病毒鞘蛋白(CP)的胺基酸序列比較結果，中間的121個胺基酸呈現高度的保守性(黑色箭頭處)。(B) 選擇將DsMV、KoMV與ZaMMV鞘蛋白之121個保守性胺基酸序列連接在一起，以作為後續表現之重組蛋白。(C) 以SDS-PAGE分析重組蛋白表現的結果，可以看到47.2 kDa的位置有明顯的重組蛋白條帶。
圖三、(A) 利用ELISA測試C4單株抗體的效價，發現其稀釋到100,000倍，都還能夠檢測到病毒。(B) 利用西方墨點分析抗體的專一性，結果顯示C4可以專一的辨識多種病毒鞘蛋白。
圖四、ELISA (A) 與西方墨點法 (B) 結果顯示C4單株抗體能專一的辨識其他九種Potyvirus屬病毒鞘蛋白。
圖五、(A) 未加入外泌訊息胜肽(PelE)之C4單鏈抗體(scFv)，會在大腸桿菌系統表現時，大量形成沒有功能的內含體(P)，堆積在細胞質內。(B) 加入外泌訊息胜肽之C4單鏈抗體，明顯看到內含體的表現量減少，可溶性C4單鏈抗體增加(S)，且可於培養基(M)中偵測到C4單鏈抗體的累積。(C) 利用西方墨點分析法來測試不同連接方式之C4單鏈抗體，可看到以VL-VH方式連接的C4單鏈抗體具有較強的訊號。
圖六、利用西方墨點法分析C4單鏈抗體與C4單株抗體的專一性，結果顯示其對於potyvirus病毒感染植株的樣品皆能有效檢測，且不會對健康植物有非專一性反應。